CRISPR/Cas9
Virussen kunnen zichzelf niet repliceren, dus injecteren ze hun DNA in een bacterie om deze te manipuleren dit DNA te repliceren. Op deze manier neemt het virus de bacterie over. CRISPR/Cas9 is een anti-viraal systeem bij bacteriën.
Werking
Stap 1:
Uitbreiding basen in CRISPR-regio
CRISPR bestaat uit stukjes prokaryotisch DNA die korte herhalingen van telkens dezelfde reeks basen bevatten. Elke herhaling wordt gevolgd door een stukje spacer-DNA. Verschillende eiwitten, zoals Cas1 en Cas2, helpen om vreemde DNA-spacers te vinden. Dit zijn stukken DNA van virussen die hun erfelijk materiaal in de bacterie hebben geïnjecteerd.
Stap 2:
Transcriptie van CRISPR
Door de transcriptie van de CRISPR-regio worden gRNA uitgedrukt. De volgorde van de nucleotiden in het DNA wordt afgelezen door het enzym RNA-polymerase. Dit enzym produceert een enkelstrengse, complementaire RNA-keten. Complementair betekent in dit geval dat de nucleotiden tussen de streng van het DNA en de streng van het RNA onderling basenparen kunnen vormen.
Stap 3:
Binding van Cas9 en het splitsen van het DNA-segment
Cas9 is een endonuclease-enzym dat het DNA op een specifieke locatie knipt, aangestuurd door gids-RNA. Het Cas9-eiwit bindt aan gRNA en vormt een effectorcomplex. Dit stuurt het eiwit naar zijn endonuclease-activiteit.
CRISPR/Cas9-effectorcomplexen bestaan uit CRISPR-RNA's (crRNA's) die sequenties bevatten die homoloog zijn aan de binnendringende nucleïnezuren en dus het gRNA zijn, tracrRNA's, een soort hulp-RNA dat bindt aan crRNA om een actief complex te vormen, en Cas-eiwitten die specifiek zijn voor elk type immuunsysteem. Deze drie componenten samen vormen een ribonucleoproteïne (RNP).
De precisie van CRISPR/Cas9 hangt af van twee factoren: de doelsequentie, die 20 basenparen lang is, en de PAM (protospacer adjacent motif). De PAM is een DNA-sequentie van 2-6 basenparen die onmiddellijk volgt op de doelsequentie van Cas9. Het DNA van de PAM is onderdeel van het binnendringende virus, maar zit niet in de CRISPR-locus. Cas9 zal niet binden aan de doelsequentie of deze splitsen als deze niet wordt gevolgd door de PAM-sequentie. Hierdoor voorkomt PAM dat de CRISPR-locus zelf wordt aangevallen en vernietigd door Cas9.
Reparatietechnieken
Op het moment dat wetenschappers CRISPR/Cas9 in het DNA van een organisme laten knippen, zorgt de cel er zelf voor dat de DNA-strengen weer worden gerepareerd. Door natuurlijke reparatieprocessen van DNA in de cel stop te zetten of te vertragen, wordt de effectiviteit van CRISPR/Cas9 een stuk hoger. Er zijn drie manieren waarop een cel een dubbelstrengsbreuk (DSB) in het DNA kan repareren:
- NHEJ (non-homologous end joining)
- TMEJ (theta-mediated end joining)
- HDR (homology directed repair)
HDR gebruikt voor het repareren van gebroken DNA-strengen een sjabloon, een validerende DNA-template, oftewel een homoloog stukje DNA dat in de kern aanwezig is. Wanneer het homologe DNA afwezig is, vindt in plaats van HDR NHEJ of TMEJ plaats, omdat deze processen geen bruik maken van een sjabloon. Dit maakt deze reparatiemethodes minder precies en het kan dan ook resulteren in een nieuwe DNA-strengvorming met verlies van informatie.
NHEJ en TMEJ kunnen geremd worden met behulp van ART558, een krachtige polymerase thèta-remmer, zodat de efficiëntie van HDR wordt verhoogd, en zodoende de effectiviteit van CRISPR/Cas9 tot wel 50% kan toenemen, ten opzichte van 5% zonder remming van NHEJ en TMEJ.
Genetische bewerkingen
Verstoren
Door een enkele snede te maken in het DNA, kan HDR resulteren in de toevoeging of verwijdering van basenparen. Hierdoor wordt de oorspronkelijke DNA-sequentie verstoord. Dit kan geninactivatie veroorzaken.
Verwijderen
Door twee gRNA's te gebruiken, kan een groter DNA-fragment verwijderd worden. NHEJ verenigt de afzonderlijke uiteinden, waardoor de tussenliggende reeks wordt verwijderd.
Corrigeren of invoegen
Door homologiegestuurde reparatie kan een cel een gen corrigeren of zelfs een nieuw gen invoegen, aan de hand van een DNA-template dat naast de CRISPR/Cas9-machinerie wordt toegevoegd.
